北京時(shí)間2022年12月16日，廣東省智能科學(xué)與技術(shù)研究院（以下簡(jiǎn)稱(chēng)廣東省智能院）王斌研究員實(shí)驗(yàn)室（腦認(rèn)知神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)發(fā)育和疾病研究組）與中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心鮑嵐研究員實(shí)驗(yàn)室以及復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院楊力研究員實(shí)驗(yàn)室合作在國(guó)際學(xué)術(shù)期刊 EMBO Reports以Resource形式在線發(fā)表了題為“ Somatosensory neurons express specific sets of lincRNAs, and lincRNA CLAP promotes itch sensation in mice”的研究論文。該研究通過(guò)單細(xì)胞測(cè)序系統(tǒng)性地分析并構(gòu)建了初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元中細(xì)胞類(lèi)型特異性的長(zhǎng)鏈基因間非編碼RNA（long intergenic noncoding RNA，lincRNA）表達(dá)譜，同時(shí)揭示細(xì)胞類(lèi)型特異表達(dá)lincRNA CLAP參與調(diào)控癢覺(jué)功能及其分子機(jī)制。
王斌研究員和鮑嵐研究員團(tuán)隊(duì)長(zhǎng)期對(duì)非編碼RNA在神經(jīng)元發(fā)育中的功能及其分子機(jī)制進(jìn)行研究。課題組前期的研究工作發(fā)現(xiàn)，初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元軸突中富集的microRNAs（miRNAs）通過(guò)調(diào)控軸突中的mRNA局部翻譯參與軸突延伸（Wang et al., Cell Reports, 2015; Wang & Bao, Journal of Molecular Cell Biology, 2017）。課題組最近的研究發(fā)現(xiàn)，軸突富集的長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）ALAE通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)RNA結(jié)合蛋白 KHSRP與Gap43 mRNA的相互作用進(jìn)而調(diào)節(jié)軸突局部翻譯和軸突生長(zhǎng)(Wei et al., Cell Reports, 2021)，lncRNA Dubr的m6A動(dòng)態(tài)修飾通過(guò)穩(wěn)定RNA結(jié)合蛋白YTHDF1/3介導(dǎo)mRNA翻譯從而參與神經(jīng)元遷移和軸突發(fā)育（Huang et al., Cell Reports, 2022），這些研究進(jìn)一步揭示了神經(jīng)元特異分布的非編碼RNA在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中發(fā)揮重要調(diào)控作用。
初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元屬于假單極神經(jīng)元，它的胞體聚集形成背根神經(jīng)節(jié)（Dorsal root ganglion，DRG）。DRG神經(jīng)元能夠把外周刺激通過(guò)脊髓進(jìn)而傳至大腦，傳遞疼痛、冷熱、癢、機(jī)械和本體等多種感覺(jué)。在DRG神經(jīng)元中存在高度特化的不同類(lèi)型神經(jīng)元，合作實(shí)驗(yàn)室張旭研究員團(tuán)隊(duì)前期的研究通過(guò)單細(xì)胞測(cè)序?qū)?/span>DRG神經(jīng)元分為10個(gè)大類(lèi)和14個(gè)亞類(lèi)，同時(shí)揭示不同類(lèi)型神經(jīng)元參與不同外周刺激的感覺(jué)傳遞（Li et a., Cell Research, 2016; Wang et al., Cell Research, 2021）。盡管對(duì)初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元的分類(lèi)和功能有所了解，但神經(jīng)元類(lèi)型特異的分子調(diào)控機(jī)制還遠(yuǎn)未研究清楚。
lincRNA是一類(lèi)轉(zhuǎn)錄自編碼基因間區(qū)域、缺乏蛋白翻譯能力且長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的非編碼RNA。目前多組學(xué)測(cè)序數(shù)據(jù)分析提示，在神經(jīng)系統(tǒng)中的lincRNA比mRNA具有更高的組織特異性，并可能發(fā)揮重要作用。因此，探究lincRNA在不同類(lèi)型DRG神經(jīng)元中的分布、功能及作用機(jī)制對(duì)解析不同外周刺激引起感覺(jué)傳遞的分子機(jī)制有重要意義。
本研究首先通過(guò)整合分析Smart-seq2和10x Genomics的初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)，構(gòu)建了單個(gè)神經(jīng)元lincRNA的表達(dá)譜。通過(guò)計(jì)算特異性指數(shù)（Specificity measure, SPM）方法篩選并發(fā)現(xiàn)了200個(gè)細(xì)胞類(lèi)型特異且高表達(dá)的lincRNA，并進(jìn)一步通過(guò)單細(xì)胞PCR、原位雜交和流式分選等方法對(duì)不同細(xì)胞類(lèi)型lincRNA進(jìn)行了驗(yàn)證。同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)細(xì)胞類(lèi)型特異的lincRNA與其基因組上臨近基因存在高度相關(guān)性，由于細(xì)胞核中定位的lincRNA能夠參與調(diào)控臨近基因的表達(dá)，提示細(xì)胞類(lèi)型特異的lincRNA可能具有順式調(diào)控作用。
單細(xì)胞測(cè)序鑒別初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元細(xì)胞類(lèi)型特異lincRNAs
隨后通過(guò)對(duì)細(xì)胞類(lèi)型特異性lincRNA的進(jìn)化保守性分析，發(fā)現(xiàn)在生長(zhǎng)抑素（Sst+）表達(dá)的神經(jīng)元中lncRNA 9130409J20Rik 特異性高表達(dá)，并且在多物種中保守性最高。利用基因共表達(dá)分析，提示lncRNA 9130409J20Rik與癢覺(jué)功能高度相關(guān)，因此我們將其命名為CLAP （Cell-type-specific LincRNA Associated with Pruritus）。進(jìn)一步采用神經(jīng)元鈣成像、小鼠鞘內(nèi)注射siRNA和AAV病毒攜帶shRNA后的癢覺(jué)行為學(xué)檢測(cè)以及RNA-seq等實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)敲低CLAP顯著抑制組胺對(duì)Sst+神經(jīng)元的激活、降低小鼠對(duì)組胺誘導(dǎo)的癢覺(jué)抓撓反應(yīng)以及導(dǎo)致Sst+神經(jīng)元中與癢覺(jué)相關(guān)基因的顯著下調(diào)。最后，通過(guò)對(duì)高通量免疫共沉淀測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)（CLIP-seq）分析、RNA免疫共沉淀和小鼠鞘內(nèi)注射siRNA等實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)RNA結(jié)合蛋白MSI2與CLAP相互結(jié)合并參與調(diào)控CLAP對(duì)癢覺(jué)相關(guān)基因的表達(dá)。
通過(guò)單細(xì)胞測(cè)序構(gòu)建初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元細(xì)胞類(lèi)型特異lincRNA表達(dá)譜并發(fā)現(xiàn)
lincRNA CLAP調(diào)控癢覺(jué)的功能和分子機(jī)制
綜上所述，本研究通過(guò)單細(xì)胞測(cè)序建立了初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元類(lèi)型特異分布的lincRNA表達(dá)譜，揭示了細(xì)胞類(lèi)型特異性表達(dá)的lincRNA在癢覺(jué)傳遞中發(fā)揮調(diào)控功能及其分子作用機(jī)制。該研究不僅有助于深入理解神經(jīng)元不同類(lèi)型特異分布的lincRNA在不同軀體感覺(jué)信息傳遞中的作用和機(jī)制，而且為疼痛和慢性瘙癢等感覺(jué)相關(guān)疾病的發(fā)生機(jī)制和臨床診療提供了理論基礎(chǔ)。
廣東省智能院王斌研究員、中科院分子細(xì)胞卓越中心鮑嵐研究組博士研究生姜博文和中科院上海營(yíng)養(yǎng)與健康研究所楊力團(tuán)隊(duì)博士研究生李國(guó)衛(wèi)為本文共同第一作者。鮑嵐研究員、楊力研究員和王斌研究員為共同通訊作者。這項(xiàng)工作得到了中科院上海高等研究院/廣東省智能科學(xué)與技術(shù)研究院的張旭研究員、廣東省智能科學(xué)與技術(shù)研究院的李昌林研究員、復(fù)旦大學(xué)腦科學(xué)研究院的韓清見(jiàn)研究員和浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院的徐貞仲研究員的大力支持。該工作得到了國(guó)家基金委、廣東省高水平創(chuàng)新研究院項(xiàng)目和中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院項(xiàng)目的資助。
文章鏈接：https://www.embopress.org/doi/abs/10.15252/embr.202154313
